EHA101  Electroporation-Competent Cell   根癌(電擊)感受態細胞

基因型：

C58 (rif R) Ti pEHA101 (pTiBo542 D T-DNA) (kanR, strepR)Nopaline

簡要說明：

EHA101菌株為C58型背景，核基因中含有篩選標簽——li福平抗性基因rif，為了便于轉化操作，此菌株攜帶一無自身轉運功能的胭脂堿型Ti質粒pEHA101 (pTiBo542DT-DNA)，此質粒含有vir基因 (vir基因是T-DNA插入植物基因組必需的元件，pEHA101 (pTiBo542DT-DNA)質粒自身的T-DNA轉移功能被破壞，但可以幫助轉入的雙元載體T-DNA順利轉移)。pEHA101(pTiBo542DT-DNA) 型Ti質粒含有篩選標簽：kan，賦予EHA101菌株ka那霉素抗性，適用于玉米、水稻、煙草等植物的轉基因操作。EHA101電轉感受態特別適用于大質粒的轉化：經pK7WGF2質粒 (zhuang觀霉素抗性，size:11876 bp)檢測轉化效率>105 cfu/μg DNA。

操作說明：

1.0.2cm電擊杯和杯蓋從儲存液中拿出倒置于干凈的吸水紙上5分鐘，待其瀝干水分，正置5分鐘，使乙醇充分揮發，待乙醇揮發干凈立即插入冰中，壓實冰面，電極杯頂離冰面0.5cm以方便蓋上杯蓋，冰中靜置5分鐘充分降溫。

2.取-80℃保存的農桿菌感受態插入冰中5分鐘，待其融化，加入1-5ug質粒DNA（質粒體積不大于6ul，最好用試劑盒抽提，雙蒸水溶解），用手bo打管底混勻，立即插入冰中，用200ul槍頭將感受態-質?；旌衔锟焖僖频诫姄舯?，蓋上杯蓋，空管保留待用。

3.啟動電轉儀，設置參數：C=25uF，PC=200ohm，V=2400V（此參數為Biorad 推薦，使用者也可按所用電轉儀推薦的protocol操作），將電擊杯快速放入電轉槽中，電擊完成快速插入冰中，加入700ul 無抗生素的LB并轉移到感受態空管中，28℃振蕩培養2~3小時。

4.6000rpm離心一分鐘收菌，留取100μl左右上清輕輕吹打重懸菌塊涂布于含相應抗生素的LB或YEB平板上，倒置放于28℃培養箱培養2-3天（當平板只含有50ug/ml kan 時，28℃培養48h即可；平板中同時加入50ug/ml kan，20ug/ml rif 時，需28℃培養60h；如果使用的平板含有50ug/ml rif 則需要28℃培養72-90h）。

注意事項：

1.加入質粒時體積不應大于感受態體積的1/10 ；質粒不純或存在鹽，乙醇等污染，轉化效率急劇下降；若轉化大質?；蛳氆@得較高轉化效率，推薦使用高純質粒提取試劑盒提取質粒。質粒增大一倍，轉化效率下降一個數量級。

2.混入質粒時應輕柔操作。

3.轉化高濃度的質?？上鄳獪p少最終用于涂板的菌量。

4.li福平濃度不應高于25ug/ul，過高的li福平濃度不利于農桿菌生長，會降低其生長速度和轉化效率。本公司感受態計算轉化效率時所用平板只含有50ug/ml kan，若所用平板含有20ug/ml rif則轉化效率降低到1/2。

5.培養基中加入li福平的目的是防止雜菌生長、篩選農桿菌；根據所用菌株抗性加入lian霉素或qing大霉素可防止Ti質粒丟失，但lian霉素不利于農桿菌的轉基因操作，所以一般培養農桿菌時不考慮lian霉素或請大霉素，Ti質粒丟失的概率極低（可以忽略）。